24 Ene 2019

Monitorización de los resultados tras la aplicación de vacunas. Parte III

pruebas de diagnóstico


AUTOR

Javier Torrubia Díaz

Diamond V

En este artículo daremos herramientas para saber si el programa de vacunación se ha llevado a cabo correctamente. Y la forma usual de monitorizarlo, es mediante la serología. La serología es una herramienta fundamental y clásica en un programa de medicina preventiva; los datos obtenidos deben ser comparados frecuentemente, de forma que sea una herramienta dinámica, que nos pueda mostrar los cambios de situación en cada granja o explotación relativos al nivel y al tipo de desafío.

  • Las pruebas serológicas detectan las respuestas humorales de anticuerpos en el huésped frente a diferentes antígenos.

Objetivos de las pruebas serológicas

  • Establecer valores considerados como standard, para una determinada prueba, enfermedad, vacuna o granja –explotación–.
  • Diagnóstico de problemas de campo, generalmente con muestras pareadas.
  • Seguimiento de programas de vacunación, para comprobar si una vacuna ha funcionado y/o para determinar el punto óptimo de vacunación o revacunación.
  • Correlacionar el rendimiento de la granja con los parámetros serológicos y guiándose por los títulos, observar si existe un problema infeccioso, o habrían de buscarse otras causas.

Términos comunes en las pruebas serológicas

  • Título: la máxima dilución de anticuerpos séricos capaz de reaccionar con un antígeno de prueba. El tipo de reacción varía según el tipo de prueba –relación en la Tabla 1–
  • Sensibilidad: La probabilidad de que un animal con un determinado título de anticuerpos sea identificado de forma correcta mediante una prueba determinada (también podría definirse como la capacidad de diferenciar muestras + de -). Generalmente sensibilidad es contraria a especificidad, aunque cada vez más se desarrollan pruebas que reúnen ambas características de forma muy aceptable.
  • Especificidad: la afinidad específica de un antígeno por su correspondiente anticuerpo –ausencia de reacciones cruzadas–. Las pruebas muy específicas tienden a ser más complicadas en cuanto a técnica.
laboratorio avicultura

Tabla1. Tipos de pruebas serológicas

Otro tema muy manido, es el número de muestras a tomar. Aunque es bastante usual recoger muestras de 15 animales, habría de tenerse en cuenta, que para alcanzar una significación estadística del 90%, se necesitarían 22 muestras.

Pruebas serológicas cualitativas

Las pruebas serológicas pueden ser cuantitativas o cualitativas. En las pruebas cualitativas, como la aglutinación en placa o la inmunodifusión en gel de agar, el resultado se expresa como positivo o negativo. En general, estas pruebas suelen ser poco sensibles y el suero normalmente no se diluye para ser procesado.

Pruebas serológicas cuantitativas

Las pruebas cuantitativas permiten detectar la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra, en el caso de la inhibición de la hemoaglutinación y la seroneutralización los sueros se diluyen en diluciones dobles seriadas y el resultado usualmente se expresa como el “título”, que indica la dilución mayor en la que se observa una reacción positiva. El título es proporcional a la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra y el resultado se expresa como la dilución, ej. 1:256, también se pueden expresar en forma de Logaritmo en base 2 ej. 1:256 = Log2 8. En otros casos, como en las pruebas ELISA, el suero sólo es diluido una vez antes de ser procesado y el resultado se basa en una reacción colorimétrica que es medida con un espectrofotómetro, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra.

Seroneutralización

Dentro de las pruebas serológicas cuantitativas, la seroneutralización está considerada de referencia para cualquier estudio serológico pues es la que más se correlaciona entre la respuesta “in vitro” y la respuesta “in vivo”. Esta prueba es sin duda alguna la más fiable, pero su complejidad, laboriosidad y elevado coste, hace que se deje para investigación o trabajos muy específicos. Se tiende a emplear pruebas menos exactas, pero más sencillas y sobre todo, más fáciles de automatizar.

Inhibición de la hemoaglutinación

Esta prueba se basa en la característica de algunos microorganismos que son capaces de aglutinar eritrocitos de mamíferos o aves. Ej: Orthomyxovirus, Paramyxovirus y Coronavirus, así como Mycoplasma. Consiste en enfrentar diluciones seriadas de una muestra frente a un antígeno con un título determinado hasta que no se produce reacción –aglutinación de los eritrocitos–. Los resultados normalmente se expresan como un título –la recíproca de la mayor dilución del suero problema que inhibe completamente la hemoaglutinación–.

Aunque es más laboriosa y menos automatizable, es preferida su utilización para algunas enfermedades como Bronquitis infecciosa en la que la abundancia de serotipos permite la aplicación de los diferentes antígenos, frente a ELISA ya que los kits disponibles comercialmente, normalmente se restringen a un solo antígeno.

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ELISA

laboratorio veterinarioEl término ELISA, acrónimo de “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”, es también conocido como EIA –enzimoinmunoensayo–. Los anticuerpos indicadores se unen a una enzima, que sirve como marcador debido a que cuando se combina con su sustrato producen un cambio de color que hace la reacción visible, pudiéndose cuantificar por la intensidad del color y su medición espectrofotométrica. No requieren instrumentos sofisticados.

Los kits ELISA proporcionan varios valores, como son:

  • La Media aritmética –o título medio que es la suma y promedio de los títulos–
  • La Media Geométrica –GMT– que viene a ser la raíz cuadrada –elevada al número de elementos analizados– de los títulos. La ventaja de este valor es que es menos sensible a valores extremos, por lo que es relevante para la interpretación de los resultados en cualquier situación del CV.
  • El coeficiente de variación –CV– que representa la dispersión de los títulos e indica cómo de variable es la respuesta del título medio en un plantel. Cuanto menor sea, más uniformes serán los títulos y mejor la vacunación. En la mayoría de los casos, tras la aplicación correcta de una vacuna inactivada, el CV debería ser <40%. Tras la aplicación de vacunas vivas, el CV debería ser <60%. Pero tras la primovacunación, más importante que el CV, es que todas las aves sean positivas.

La principal ventaja de la prueba ELISA es la capacidad de automatización y de procesamiento de grandes cantidades de muestras, así como la disponibilidad de diferentes kits comerciales, por lo que es la prueba más utilizada.

Sin embargo también muestra limitaciones, como son su poca aceptación o difícil correlación en algunas enfermedades como EDS, pneumovirus, laringotraqueitis, etc.

Limitaciones y aplicaciones prácticas

A excepción de la seroneutralización, ninguna de las pruebas serológicas por sí misma indica grado de protección, sino que indican el nivel de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular. Este nivel de anticuerpos debe ser racionalmente interpretado. La evaluación rutinaria y periódica del título de anticuerpos deberá correlacionarse con los calendarios de vacunación, el comportamiento clínico y el rendimiento productivo del lote para establecer los parámetros esperados de acuerdo a la edad y a la función zootécnica de las aves para establecer los niveles considerados “normales” e interpretar adecuadamente las variaciones de la “normalidad” como inmunidad insuficiente, exposición de campo no controlada o enfermedad clínica aparente.

Las llamadas “líneas de base” indican el nivel normal esperado de anticuerpos en un lote a una edad determinada, permiten identificar con facilidad los cambios y se pueden correlacionar.

Se ha de ser muy cauto a la hora de hacer predicciones sobre títulos protectivos. En primer lugar porque el grado de protección depende de muchas variables como:

  • Las cepas vacunales utilizadas
  • La virulencia de las cepas de campo involucradas
  • El tipo de ave
  • El programa y método de aplicación de la vacuna
  • Otras variables locales

También hay otras variables dependientes de la prueba en sí, como:

  • La afinidad del antígeno
  • La calidad de kits
  • La variabilidad de lotes o placas
  • Las tasas de dilución
  • Tiempo incubación
  • Sueros de control
  • El laboratorio –equipos, reactivos, personal, técnica, temperatura y humedad, calidad del agua, lectores, etc–

En las tablas siguientes se dan los títulos serológicos medios esperables según los fabricantes de los kits y experiencia personal. Para broilers, los títulos se refieren a la edad de sacrificio, a menos que se mencione específicamente y para aves de vida larga, se dan los títulos unas 4 a 6 semanas después de la vacunación mencionada

pruebas laboratorio
pruebas laboratorio

En la Tabla 4, se expresan los títulos para la enfermedad de Gumboro, para la que existen diferentes vacunas y kits con resultados claramente diferentes.

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Conclusiones

La serología es una herramienta fundamental y clásica en el programa de medicina preventiva; los datos obtenidos deben ser comparados frecuentemente. Uno de sus objetivos es el seguimiento de programas de vacunación, para comprobar si una vacuna ha funcionado y/o para determinar el punto óptimo de vacunación o revacunación.

Existen muchas variables que influyen en la interpretación correcta de los resultados.

Hay variables dependientes del animal, del tipo de prueba, del laboratorio, de la muestra, del tipo de vacunación, de la vacuna y del tiempo transcurrido hasta la toma de muestras. Por todo ello se ha de ser muy cauto a la hora de hacer evaluaciones y predicciones, se necesita mucha información y experiencia.



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